关于OECD 497（皮肤致敏性DA指南）的解读

日前，ECHA向注册者发布了关于在评估化学品的皮肤致敏性时如何可靠地结合不同来源的替代数据的建议。该建议是基于经合组织（OECD）的一份名为《Guideline on Defined Approaches for Skin Sensitisation》的新指南，由OECD皮肤致敏性判定方法专家组（OECD Expert Group on Defined Approaches for Skin Sensitisation；EG DASS）制定完成。该指南包含评估一种物质是否为皮肤致敏剂的明确方法，并对致敏性强弱进行分类。这种分类非常重要，因为REACH要求评估皮肤致敏的效力。如果采用这种判定方法（defined approaches，DAs）在皮肤致敏性和效力方面得出结论，将可以取代目前常用的体内淋巴结试验（LLNA），从而减少对动物的测试。

皮肤致敏剂（skin sensitiser）是一类皮肤重复接触后产生皮肤致敏反应的物质。皮肤致敏反应一般是由于致敏物与体内蛋白质的共价结合。它是一个由分子启动并产生系列关键事件（key events, KEs），最终造成过敏性皮炎的作用过程。分子启动是第一个关键事件（KE1），由皮肤蛋白质中亲电物质与亲核中心的共价结合开始，即蛋白结合（protein binding）。第二个关键事件（KE2）发生在角质形成细胞中，包括炎症反应以及与特定细胞信号通路（如抗氧化/电泳反应元件（ARE）依赖通路）相关的基因表达变化，即角化细胞活化（keratinocyte activation）。第三个关键事件（KE3）是树突状细胞的激活（dendritic cell activation），通常通过特定细胞表面标志物、趋化因子和细胞因子的表达来评估。第四个关键事件（KE4）是T细胞增殖，最终造成过敏性接触性皮炎。

根据该指南，致敏性判定的方法（DA）为使用一组定义的信息源生成一个固定的数据解释程序（DIP）（如数学模型、基于规则的方法）并应用于目标物质，以得出预测，而无需专家判断。致敏性判断的信息源（数据）一般来自体外化学分析法(in chemico)、体外试验（in vitro）和计算机模拟评价(in silico)等。多个信息源的数据可以在DAs中一起使用以获得与动物试验相同或更好的预测能力，从而预测人类的反应。DAs的方法组合可以克服个别独立方法的一些局限性，以提高对获得的总体结果的可信度。

在使用DA之前，测试实验室应考虑所有有关测试化学品的相关信息，如测试化学品的识别特征（CAS，SMILES等）、化学结构、物理化学性质、毒理学数据（如果可用）等，以确定该特定DA是否适用于试验化学品。

该DAs中包含196种化学品的综合数据集，包括DA预测数据、个人信息源数据、高度精确的LLNA和人类斑贴预测试验（HPPT）数据以及理化性质数据。这些化学品中，168种具有LLNA分类，66种化学品具有HPPT分类，这些分类均经EG DASS认可，并用于评估DAs的性能。该数据集主要包含化妆品成分，但也包含跨领域使用的其他类型的化学品，如防腐剂、染料或食品成分。数据集的化学成分多种多样，如这些化学品所涵盖的物理化学性质所示：它包含小分子和大分子（分子量范围为30至512 g/mol）、疏水性和亲水性物质（对数P范围为-3.9至9.4）、固体和液体（熔点范围为-122至253ºC）、挥发性和非挥发性物质（沸点范围为-19至445ºC）等。

该指南中推荐的DAs目前共有以下三种：

1、“三取二”（2o3）策略，用于评估皮肤致敏性危害（分阴性、阳性）。该策略包含OECD正式描述的导致皮肤过敏KEs前三个中的至少两个。KE1：蛋白质结合（直接肽反应性分析（direct peptide reactivity assay，DPRA））；KE2：角化细胞活化（KeratinoSens™）；KE3：树突状细胞激活（人类细胞系激活试验（human cell line activation test，h-CLAT））。2o3 DA中的数据解释程序（data interpretation procedure，DIP）是一种透明、基于规则的方法，无需专家判断。该策略通过KE1-3相关的三种国际公认的非动物分析方法（即DPRA、KeratinoSens™、h-CLAT），以未定义的顺序进行连续测试，预测皮肤过敏风险。对两个KEs进行分析，如果这些分析的结果一致，则相应地预测化学品为阴性或阳性。如果前两次分析结果不一致，则运行剩余KE的分析。

2、基于UN GHS效力分类的综合测试策略（Integrated Testing Strategy，ITSv1），用于评估皮肤致敏性危害和效力（分GHS 1A、1B和NC，即强致敏性、中等到弱致敏性、无分类）。该策略包括导致皮肤过敏KEs中的KE1和KE3，并包括对皮肤致敏性的计算模拟预测（in silico）。使用DPRA定量评估蛋白质结合（KE1），按致敏性强弱评0-3分；h-CLAT定量评估树突状细胞激活（KE3），按致敏性强弱评0-3分；(Q)SAR软件Derek Nexus（ITSv1）提供了对皮肤敏感性的计算模拟预测，按有无致敏性评0-1分。DPRA或h-CLAT其中一种方法可用时，既可进行评估，三种方法均可用时，评估结果最为可靠确切。具体分类方法如下：

3、基于ITSv1修改后的策略（ITSv2），用于评估皮肤致敏性危害和效力（分GHS 1A、1B和NC，即强致敏性、中等到弱致敏性、无分类）。该方法将ITSv1中计算模拟预测方法由Derek Nexus软件变更为OECD QSAR Toolbox。评估执行策略与ITSv1基本一致。

三种方法的部分预测性能数据如下：

注：敏感性（sensitivity, Sens)）表示真阳性率，特异性（specificity, Spec）为真阴性率，平衡准确度（balanced accuracy, BA）为敏感性和特异性的平均值。由于参考数据的不平衡性，同一方法的不同分类结果存在差异。

这三种DAs均具有较高的准确度，在具体使用过程中，还可通过结合实际物质情况选择合适方法及策略以达到更高的预测准确度。其中，有些DAs并不适用于金属、无机化合物、UVCB和混合物等物质。另外，在采用LLNA数据运行DPRA 、KeratinoSens™、h-CLAT等DAs预测Log P > 3.5类物质时灵敏度比较低，而且采用LLNA数据相比HPPT数据更容易出现假阳性结果，即目前的参考物质数量不足以对Log P > 3.5的物质得出确定度高的结论。

此外，在临界判断范围附近的单个分析结果可能会产生不确定的DA预测（低置信度），该指南对每种DA的临界判断范围进行了说明。如DPRA方法的结果临界范围为4.95% - 8.32%，当肽链消耗小于4.95%时则可初步判定为阴性，大于8.32%则为阳性。为了避免临界范围导致的错误判断，KeratinoSens™、h-CLAT两种方法均需要多次运行。在DPRA方法中，当肽链消耗在3-10%（仅使用半胱氨酸时则为9%-17%）之间时也要多次运行以得到确切结果。例如初次运行结果为3%~4.95%，则进行第二次运行，两次结果为阴性则最终结果为阴性，如果两次不一致则运行第三次，取其中两次相同的结果作为最终结果（阴性、阳性或临界值（Borderline））。

对于最终危害/效应分类，具有高置信度的DA预测被认为是决定性的，低置信度的DA预测则是非决定性的（Inconclusive）。例如Log P>3.5的化学品获得的阴性h-CLAT结果具有较低的置信度，可能会导致不确定的2o3 DA预测。该指南也专门对不同的DA置信度结果进行了最终危害/效应分类说明。

策略ITSv1和ITSv2分别用到了QSAR预测工具Derek Nexus和OECD QSAR Toolbox，只有在DPRA和h-CLAT中至少一种方法可用的情况下才有使用QSAR预测的必要，否则这两种DAs均不可使用。指南中也对两种QSAR预测工具的使用方法和应用范围进行了说明。

总的来说，OECD的这个皮肤致敏性判定指南将多种方法原理进行结合用于未知物质的皮肤致敏性判断，即保证了准确率，操作难度也不高，可以在不进行动物试验的情况下很好的解决致敏性判定的问题，符合人道主义精神的同时还能节省试验周期。ECHA目前已经认可该方法并建议注册单位积极采用该方法获取数据。相关REACH注册企业也可以积极响应起来，将该方法应用到实际产品的注册中。